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RT‑nfo RNA恒温快速扩增试剂盒(试纸条型)

一.原理概述：
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，特殊修饰的反转录酶利用特异性引物和模板RNA合成cDNA链，反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA链为模板进行快速核酸扩增反应。依赖nfo酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用胶体金技术（三明治夹心法）可以对最终结果进行检测。

二.产品特点：
本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需12 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。
本试剂对设备要求低，金属浴、水浴锅等即可进行反应操作，无需购买PCR扩增仪等价格高昂的专属设备。

三.试剂盒组成：

组成	含量
A buffer	1.6 mL×1管
B buffer	150 μL×1管
试剂	48份
使用说明书	1份

四.试剂盒储存：
运输条件：低温运输；
储存条件：储存温度 ≤ ‑20 ºC，避光保存，避免重压、反复冻融；
产品有效期：12个月。

五.引物设计：
1. 建议使用长度在 30‑35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；
2. 碱基排布随机性高，GC 含量在 30%‑70%之间；
3. 下游引物的5’端标记一个修饰基团（常用生物素Biotin）；
4. 引物设计避免形成二级结构而影响扩增；
5. 扩增子长度建议在150‑300 bp，通常不超过500 bp。

荧光探针设计：
在上下游引物中间，设计一段长度为 46‑52nt 与目的片段互补的序列作为胶体金探针；
探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为 46‑52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。

探针共有三个修饰位点：
1. 5’端修饰一个抗原标记（FAM）；
2. 在距 5’端约 30nt 序列位置上标记一个dSpacer（THF,四氢呋喃），作为 nfo 的识别位点；
3. THF 距离 3’末端约 15 nt，并且 3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或 C3‑spacer。

引物探针修饰示例
1. 下游引物修饰示例：
下游引物序列：5’‑CGCTGACTGCGTGCATGACCGTACCAACCG‑3’
下游引物修饰：[5’‑biotin]‑CGCTGACTGCGTGCATGACCGTACCAACCG‑3’
2. 探针修饰示例：探针序列：
5’ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAGCTCTCAAAGATGGACC‑3’

探针修饰：
[5’FAM]‑ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAG[THF]TCTCAAAGATGGACC‑[3’C3spacer]

六.操作步骤：提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
1.每个干粉反应管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；
2.每个反应管分别加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针（引物和探针浓度为10 μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中）；
3.向反应管中依次加入11.5 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为13.5 μL）；
4.最后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧，上下颠倒反应管8‑10次混匀），请务必上下颠倒甩动反应管8‑10次进行混匀；
5.混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中42 ºC孵育8‑12 mins；
6.反应结束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的离心管中，混合均匀后，将胶体金试纸条的样品端插入离心管中平衡，5 mins内观察质控线与检测线判读结果。

反应体系配制如下表：

组分	体积（μL）
A buffer	29.4
上游引物(10 μM)	2
下游引物(10 μM)	2
探针(10 μM)	0.6
ddH2O和核酸模板	13.5
B buffer	2.5
总体积	50

七.注意事项
1.由于试剂盒灵敏度非常高，在进行反应时请注意避免微量核酸污染，并尽量考虑设置空白对照以确认是否有核酸污染。
试剂盒保质期12个月。每次使用时，请取出实验所需的反应单元的数量，置于冰浴条件下并在8小时内使用；剩余部分，请置于存储条件下。