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组织细胞microRNA快速提取试剂盒(离心柱型)

Tissue Cell microRNA Kit

包装规格：

本产品仅用于科研，禁止用于医药、临床医疗、食品和化妆品等用途。

一.产品介绍：
    近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15¬-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的试剂盒。但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA。本试剂盒采用独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除， 最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点：
1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
2.也不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。
3.快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
4.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留,可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

三.适用范围：
   适用于快速提取各种细胞组织miRNA和其它各种小RNA。

四.储存条件：
1.Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入无水乙醇后，可以在常温保存。
2.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。
3.运输在常温下进行，不影响使用效果。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.注意事项：
1.第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
2.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3.需要自备乙醇，氯*，一次性注射器，研钵。
4.Lysis/Binding buffer 和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.预防RNase 污染，应注意以下几方面：
 1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。
 2)使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
 3)RNA 在裂解液中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
 4)配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
6.RNA 纯度及浓度检测：
完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

六.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
   提示：
         第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇！
1.组织培养细胞
 a.收集<107悬浮细胞到一个1.5ml离心管。（对于贴壁细胞，孔板培养和细胞瓶培养可以直接裂解，尽可能吸干净所有培养液残留后直接加入1ml的Lysis/Binding buffer, 迅速轻摇使Lysis/Binding buffer充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活RNA酶，轻轻用移液枪反复吹打混匀接操作步骤项下3。）

 b.13，000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。

 c.轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入1ml Lysis/Binding buffer，涡旋或者吹打，充分裂解混匀。

 d.接操作步骤项下3。

2.动物组织（例如鼠肝脑）
 a.新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,根据处理组织的质量，按照50-100mg加入1ml的比例加入Lysis/Binding buffer后电动或者手动彻底匀浆。或者在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉（约50-100mg）转入装有1ml Lysis/Binding buffer的1.5ml离心管中,剧烈吹打涡旋混匀。

 b.可选,一般不需要：如果处理量大,有明显颗粒或者不溶物,非常粘稠或者裂解不充分, 可立即用带针头的一次性 5 ml(约0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。

 c.接操作步骤项下3。

3.室温放置5分钟以充分分离核酸蛋白复合物。

4.加入200μl 氯*，剧烈振荡15秒。

5.室温放置2-3分钟，13，000rpm离心10分钟。

6.小心取上清（约600μl）转入到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇（必须是室温的，通常900μl），涡旋混匀。此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心，立刻接下步。

7.将混合物(每次小于700μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30-60秒，弃掉废液。

8.加700μl Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙醇!），12，000rpm 离心30秒，弃掉废液。

9.加入500μl Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl Wash Solution 2/3,重复一遍。

10.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 100℃水浴中预热效果更好）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

12.如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤11, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高, 分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高1 5–30%, 但是浓度要低,用户根据需要选择。

附：microRNA富集方法（仅仅提取microRNA，不包含>200 nt其它总RNA成份。）
1.按照前面标准操作步骤1－5操作，直到得到上清。

2.较精确估计上清体积（约600μl），加入等体积70％乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。

3.将混合物加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30-60秒，收集滤过物。将滤过物从收集管转移到一个新的离心管后，把吸附柱子放回空的收集管内，再加入剩下的混合物，离心，收集滤过物。合并两次滤过物，计算体积。此时，滤过物含有microRNA, 吸附柱子上面是除去了microRNA的总RNA（不包含microRNA），如果需要，可以按照前面标准操作步骤8－11操作漂洗，洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。

4.较精确估计滤过物体积，加入0.65倍体积无水乙醇（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。

5.取一套新的microRNA吸附柱MA，将上一步骤混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入microRNA吸附柱MA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30秒，弃掉废液。

6.按照前面标准操作步骤8－11操作漂洗，洗脱得到富集的microRNA。

注意：不同的实验可以选择不同的方法，例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等，可能减少某些下游试验的扩增背景，当背景较高或者非特异扩增较多时，可以尝试使用富集方法提取的microRNA。

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