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HyPure组织细胞microRNA快速提取试剂盒(离心柱型)

HyPure组织细胞microRNA提取试剂盒2142,适用于快速提取各种细胞组织miRNA和其它各种小RNA,无需有毒的苯酚/氯仿抽提/乙醇沉淀等步骤,使用基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留,无需DNase消化,无DNA残留,也无杂质残留,RNA纯度极高,适合于对纯度要求很高的下游实验,如real-time RT-PCR和RNA-Seq。

产品编号:2142

产品规格:50次/200次

产品价格:2185/8300

包装:

储存条件:4℃

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HyPure™组织细胞microRNA快速提取试剂盒(离心柱型)

HyPure™ Tissue Cell microRNA Kit


包装规格:

2142A HyPure™组织细胞microRNA快速提取试剂盒(离心柱型) 50次 2185元
2142B HyPure™组织细胞microRNA快速提取试剂盒(离心柱型) 200次 8300元


本产品仅用于科研,禁止用于医药、临床医疗、食品和化妆品等用途。


一.产品介绍:
    近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15¬-30核苷酸左右大小RNA(包括siRNA和miRNA)的试剂盒。但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收,酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA。本试剂盒采用独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,强烈有机抽提去除蛋白和DNA,RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质进一步去除, 最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点:
1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。
2.也不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。
3.快速,简捷,单个样品操作一般可在30分钟内完成。
4.多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.9~2.0,基本无DNA残留,可用于RNAi,RT-PCR,Northern-blot和各种实验。

三.适用范围:
   适用于快速提取各种细胞组织miRNA和其它各种小RNA。

四.储存条件:
1.Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入无水乙醇后,可以在常温保存。
2.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体,并不影响使用,直接不吸晶体,吸上清使用就可以。
3.运输在常温下进行,不影响使用效果。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.注意事项:
1.第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
2.所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3.需要自备乙醇,氯*,一次性注射器,研钵。
4.Lysis/Binding buffer 和Wash Solution 1含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.预防RNase 污染,应注意以下几方面:
 1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase 污染。
 2)使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
 3)RNA 在裂解液中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
 4)配制溶液应使用无RNase 的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%( v/v),37℃放置过夜,高压灭菌。)
6.RNA 纯度及浓度检测:
完整性:RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA,电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb,分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍,否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA,OD260/OD280 读数(10mMTris, pH7.5)在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品,假定在10mM Tris,pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间,但这并不表示RNA 不纯。
浓度:取一定量的 RNA 提取物,用RNase-free 水稀释n 倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260, OD280 测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

六.操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
   提示:
         第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇!
1.组织培养细胞
 a.收集<107悬浮细胞到一个1.5ml离心管。(对于贴壁细胞,孔板培养和细胞瓶培养可以直接裂解,尽可能吸干净所有培养液残留后直接加入1ml的Lysis/Binding buffer, 迅速轻摇使Lysis/Binding buffer充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活RNA酶,轻轻用移液枪反复吹打混匀接操作步骤项下3。)


 b.13,000rpm离心10秒(或者300g离心5分钟),使细胞沉淀下来。完全吸弃上清,留下细胞团,注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。


 c.轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬,加入1ml Lysis/Binding buffer,涡旋或者吹打,充分裂解混匀。


 d.接操作步骤项下3。


2.动物组织(例如鼠肝脑)
 a.新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,根据处理组织的质量,按照50-100mg加入1ml的比例加入Lysis/Binding buffer后电动或者手动彻底匀浆。或者在液氮中研磨组织成细粉后,取适量组织细粉(约50-100mg)转入装有1ml Lysis/Binding buffer的1.5ml离心管中,剧烈吹打涡旋混匀。


 b.可选,一般不需要:如果处理量大,有明显颗粒或者不溶物,非常粘稠或者裂解不充分, 可立即用带针头的一次性 5 ml(约0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。


 c.接操作步骤项下3。


3.室温放置5分钟以充分分离核酸蛋白复合物。


4.加入200μl 氯*,剧烈振荡15秒。


5.室温放置2-3分钟,13,000rpm离心10分钟。


6.小心取上清(约600μl)转入到新的离心管,加入1.5倍体积的无水乙醇(必须是室温的,通常900μl),涡旋混匀。此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心,立刻接下步。


7.将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)12,000 rpm离心30-60秒,弃掉废液。


8.加700μl Wash Solution 1(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。


9.加入500μl Wash Solution 2/3(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。加入500μl Wash Solution 2/3,重复一遍。


10.将吸附柱RA放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。


11.取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water(事先在 100℃水浴中预热效果更好), 室温放置1分钟,12,000 rpm 离心1分钟。


12.如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤11, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高, 分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高1 5–30%, 但是浓度要低,用户根据需要选择。


附:microRNA富集方法(仅仅提取microRNA,不包含>200 nt其它总RNA成份。)
1.按照前面标准操作步骤1-5操作,直到得到上清。


2.较精确估计上清体积(约600μl),加入等体积70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!)(必须是室温的),涡旋或者吹打充分混匀,不要离心。


3.将混合物加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)12,000 rpm离心30-60秒,收集滤过物。将滤过物从收集管转移到一个新的离心管后,把吸附柱子放回空的收集管内,再加入剩下的混合物,离心,收集滤过物。合并两次滤过物,计算体积。此时,滤过物含有microRNA, 吸附柱子上面是除去了microRNA的总RNA(不包含microRNA),如果需要,可以按照前面标准操作步骤8-11操作漂洗,洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。


4.较精确估计滤过物体积,加入0.65倍体积无水乙醇(必须是室温的),涡旋或者吹打充分混匀,不要离心。


5.取一套新的microRNA吸附柱MA,将上一步骤混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入microRNA吸附柱MA中,(吸附柱放入收集管中)12,000 rpm离心30秒,弃掉废液。


6.按照前面标准操作步骤8-11操作漂洗,洗脱得到富集的microRNA。


注意:不同的实验可以选择不同的方法,例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等,可能减少某些下游试验的扩增背景,当背景较高或者非特异扩增较多时,可以尝试使用富集方法提取的microRNA。


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根据具体样品数量,组织RNA提取难度,酌情收取少量RNA提取费用,内参免费;


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2. 专业的引物设计技能,保证qPCR引物的特异性;

3. 熟练的qPCR操作技能,保证完美的qPCR结果;

qPCR实验流程图

送样要求:

1. 细胞(≥106 )、新鲜动植物组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、叶片(≥100mg)等样品材料,基因组DNA或总RNA(总RNA>2μg,体积≥20μl,浓度≥100 ng/μl)。
2. 靶基因信息和背景资料:基因序列或GenBank Accession Number等,生物物种信息(Human、Mouse、Rat 等)、DNA/RNA 来源、基因丰度等。

提供服务:
引物探针设计合成,RNA提取,反转录,RNA电泳,引物筛选,上机定量检测。

提交结果:
原始数据(CT值和各种统计值,融化温度图,扩增曲线图,电泳图,柱状图)、数据分析结果及详细实验报告。