外源蛋白单独表达pBET-5 T载体试剂盒-无缝克隆-Genenode|君诺德公司

外源蛋白单独表达pBET-5 T载体试剂盒

pBET-5载体是高效表达T载体，线性化载体3’-末端含有突出的碱基“T”，可以将3’-末端含有“A”的PCR扩增产物高效率的连接至pBET-5载体上。同时该载体含有完整的表达元件，如Lac启动子、RBS、转录终止子等。此外，在表达框内C-末端含有His6标签和c-myc标签序列，可以与外源基因融合表达，得到C-末端融合有His6和c-myc标签的蛋白，该融合蛋白可以用His6标签进行亲和纯化，还可以用抗c-myc标签的抗体进行检测。本试剂盒中含有的高效连接液Ligation Mixture可以方便的将载体和外源片段进行高效连接，反应产物可以直接用于转化。

产品特色：
一步法完成基因克隆与表达载体的构建，所得到的阳性质粒载体可以直接用于表达。节约时间、节约成本。

组分：

pBET-5（70 ng/μl）	20 μl 1支
Ligation Mixture	75 μl 2支
PNETR primer	150 μl 1支

保存条件：
保存温度：-20℃

使用方法：

1、在微量离心管中配制以下DNA溶液，全量为5 μl。

pBET-5	1 μl（70 ng）
PCR片段	适量
水	补足至5 µl

2、加入5 μl的Ligation Mixture。
3、4 ℃反应过夜或者16 ℃连接2小时至4小时。将10 μl连接混合液加入100 μl感受态细胞中，冰水浴放置30分钟。
4、迅速置于42℃水浴热激2分钟，迅速在冰水浴放置2分钟。
5、加入900 μl 2YT（或LB）培养基，37 ℃，180 rpm振荡培养45分钟。高速离心收集菌体，去掉800 μl上清，留200 μl重悬细胞。
6、将200 μl细胞重悬液涂布在含有相应抗生素的琼脂平板培养基上，37 ℃倒置培养过夜，形成单克隆。挑取单菌落，鉴定阳性克隆。

注意事项：
1、连接反应请在16 ℃以下进行，温度升高较难形成环状DNA。连接时间控制在4 ℃反应过夜或者16 ℃反应2小时至4小时。对于较难连接的反应，可以4 ℃过夜和16 ℃连接2小时交替连接。反应时间过短或者温度高较难筛选得到阳性克隆。
2、为提高克隆鉴定的效率，尽量减少假阳性，保证鉴定克隆为正向插入克隆，在用PCR方法进行阳性克隆鉴定时，应采用载体上游引物和扩增片段的下游引物进行鉴定或者采用载体下游引物和扩增片段的上游引物进行鉴定。

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