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GST标签融合表达T载体试剂盒

pBET-3载体是高效表达T载体，线性化载体3’-末端含有突出的碱基“T”，可以将3’-末端含有“A”的PCR扩增产物高效率的连接至pBET-3载体上。同时该载体含有完整的表达元件，如T7启动子、RBS、转录终止子等。此外，在表达框内N-末端含有GST标签序列，C-末端含有His6标签，双标签都可以与外源基因融合表达，得到N-末端融合有GST标签和C-末端有His6标签的蛋白，该融合蛋白可以用GST亲和层析纯化，也可以用His6标签进行亲和纯化。

本试剂盒中含有的Ligation Mixture高效连接液可以方便的将载体和外源片段进行高效连接，反应产物可以直接用于转化。

产品特色：
一步法完成基因克隆与表达载体的构建，所得到的阳性质粒载体可以直接用于表达。节约时间、节约成本。

组分：

pBET-3（70 ng/µl）	5 μl  1支
Ligation Mixture	75 μl   2支
T7t primer（10pmol/µl）	150 μl  1支

保存条件：

保存温度：-20 ℃

使用方法：
1. 在微量离心管中配制以下DNA溶液，全量为5 μl。

pBET-3	1 μl（70 ng）
PCR片段	适量
纯水	补足至5 µl

2. 加入5 μl的Ligation Mixture。
3. 4 ℃反应过夜或者16 ℃连接2小时至4小时。将10 μl连接混合液加入100 μl感受态细胞中，冰水浴放置30分钟。
4. 迅速置于42 ℃水浴热激2分钟，迅速在冰水浴放2分钟。
5. 加入900 μl 2YT（或LB）培养基，37 ℃，180 rpm振荡培养45分钟。高速离心收集菌体，去掉800 ul上清，留200 μl重悬细胞。

注意事项：
1. Ligation Mixture溶液请于冰水浴中溶解，混匀后再使用。
2. 连接反应请在16 ℃以下进行，温度升高较难形成环状DNA。连接时间控制在4 ℃反应过夜或者16 ℃反应2小时至4小时。对于较难连接的反应，可以4 ℃过夜和16 ℃连接2小时交替连接。反应时间过短或者温度高较难筛选得到阳性克隆。
3. 为提高克隆鉴定的效率，尽量减少假阳性，保证鉴定克隆为正向插入克隆，在用PCR方法进行阳性克隆鉴定时，应采用载体上游引物和扩增片段的下游引物进行鉴定或者采用载体下游引物和扩增片段的上游引物进行鉴定。