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SUMO标签融合表达T载体试剂盒

pBET-4载体是高效表达T载体，线性化载体3’-末端含有突出的碱基“T”，可以将3’-末端含有“A”的PCR扩增产物高效率的连接至pBET-4载体上。同时该载体含有完整的表达元件，如T7启动子、RBS、转录终止子等。此外，在表达框内N-末端含有His6标签和SUMO标签序列，可以与外源基因融合表达，得到N-末端融合有His6和SUMO标签的蛋白，该融合蛋白可以用His6标签进行亲和纯化，融合蛋白可以用SUMO蛋白酶进行标签切除，得到无外源多余氨基酸残基的目的蛋白。


附：外源基因扩增引物设计：
上游引物: 5’-NNN……NNN-3’
下游引物: 5’-NNN……NNN-3’
NNN：表示对框的外源基因编码序列，可以参照如上所示的载体序列确定。

产品特色：
一步法完成基因克隆与表达载体的构建，所得到的阳性质粒载体可以直接用于表达。节约时间、节约成本。

组分：

pBET-4（70ng/µl）	20μl  1支
Ligation Mixture	75μl  2支
PNETR primer（10pmol/µl）	150μl  1支

保存条件：
运输温度：2-8℃            保存温度：-20℃
有效日期：12个月

使用方法：
1. 在微量离心管中配制以下DNA溶液，全量为5μl。

pBET-4	1μl（70ng）
PCR片段	适量
水	补足至5µl

2. 加入5μl的Ligation Mixture。

3. 4℃反应过夜或者16℃连接2小时至4小时。将10μl连接混合液加入100μl感受态细胞中，冰水浴放置30分钟。
4. 迅速置于42℃水浴热激2分钟，迅速在冰水浴放2分钟。
5. 加入900μl 2YT（或LB）培养基，37℃，180rpm振荡培养45分钟。高速离心收集菌体，去掉800ul上清，留200μl重悬细胞。
6.  将200μl细胞重悬液涂布在含有相应抗生素的琼脂平板培养基上，37℃倒置培养过夜，形成单克隆。挑取单菌落，鉴定阳性克隆。

注意事项：
1. Ligation Mixture溶液请于冰水浴中溶解，混匀后再使用。
2. 连接反应请在16℃以下进行，温度升高较难形成环状DNA。连接时间控制在4℃反应过夜或者16℃反应2小时至4小时。对于较难连接的反应，可以4℃过夜和16℃连接2小时交替连接。反应时间过短或者温度高较难筛选得到阳性克隆。
3. 为提高克隆鉴定的效率，尽量减少假阳性，保证鉴定克隆为正向插入克隆，在用PCR方法进行阳性克隆鉴定时，应采用载体上游引物和扩增片段的下游引物进行鉴定或者采用载体下游引物和扩增片段的上游引物进行鉴定。
附：鉴定与测序引物：
载体上游引物T7primer（通用引物）:
5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’
载体下游引物PNETR primer:
5’-GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
4. 感受态细胞的选择：转化时请使用高效的感受态细胞，热激感受态细胞转化效率应≧1ⅹ107cfu/ug pUC18，这样才可能得到比较理想的阳性克隆。
5. 插入DNA片段的选择：PCR片段扩增过程中，应该尽量采用能得到单一条带的扩增条件。在片段扩增的过程中，循环数可以控制在15～25循环之间，并且要进行胶回收，避免引物等杂质的存在。
6. 插入 DNA片段使用量的计算方法：进行克隆时，载体：片段的摩尔比一般为1：3～1：10 ，一般根据实验需要选择合适的载体和片段的摩尔比。