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碱性磷酸酶(AP)融合表达pBET-1 T 载体试剂盒

产品简介：

pBET-1载体是高效表达T载体，线性化载体3’-末端含有突出的碱基“T”，可以将3’-末端含有“A”的PCR扩增产物高效率的连接至pBET-1载体上。同时该载体含有完整的表达元件，如Plac启动子、RBS、转录终止子等。此外，在表达框内还含有碱性磷酸酶（AP）基因序列，可以与外源基因融合表达，得到C-末端融合有AP的蛋白，可以直接用于显色反应，检测外源蛋白有无表达及相对表达量。本试剂盒中含有的Ligation Mixture高效连接液可以方便的将载体和外源片段进行高效连接，反应产物可以直接用于转化。

本试剂盒中含有的Ligation Mixture高效连接液可以方便的将载体和外源片段进行高效连接，反应产物可以直接用于转化。

产品特色:
一步法完成基因克隆与表达载体的构建，所得到的阳性质粒载体可以直接用于表达。节约时间、节约成本。

产品组成：

pBET-1 （100ng/µl）	20μl      1支
Ligation Mixture	75μl       2支
Plbu primer（10pmol/µl）	150 μl    1支
Apd1 primer（10pmol/µl）	150 μl    1支

保存条件:
运输温度：2-8℃            保存温度：-20℃            有效日期：12个月

产品说明：

1.感受态细胞的选择转化时请使用高效的感受态细胞，热激感受态细胞转化效率应≧1ⅹ107cfu/µg pUC18，这样才可能得到比较理想的阳性克隆。
2.插入 DNA片段的选择PCR片段扩增过程中，应该尽量采用能得到单一条带的扩增条件。在片段扩增的过程中，循环数可以控制在15～25循环之间，并且要进行胶回收，避免引物等杂质的存在。
3.插入 DNA片段使用量的计算方法进行克隆时，载体：片段的摩尔比一般为1：3～1：10 ，一般根据实验需要选择合适的载体和片段的摩尔比。

使用方法：
1.在微量离心管中配制以下DNA溶液，全量为5µl。

pBET-1	1μl（100ng）
PCR片段	适量
纯水	补足至5µl

2.加入5µl的Ligation Mixture。 
3.4℃反应过夜或者16℃连接2小时至4小时。将10μl连接混合液加入100μl感受态细胞中，冰水浴放置30分钟。
4.迅速置于42℃水浴热激2分钟，迅速在冰水浴放2分钟。
5.加入900μl 2YT（或LB）培养基，37℃，180rpm振荡培养45分钟。高速离心收集菌体，去掉800μl上清，留200μl重悬细胞。
6.将200μl细胞重悬液涂布在含有相应抗生素的琼脂平板培养基上，37℃倒置培养过夜，形成单克隆。挑取单菌落，鉴定阳性克隆。

注意事项：
1.Ligation Mixture溶液请于冰水浴中溶解，混匀后再使用。
2.连接反应请在16℃以下进行，温度升高较难形成环状DNA。连接时间控制在4℃反应过夜或者16℃反应2小时至4小时。对于较难连接的反应，可以4℃过夜和16℃连接2小时交替连接。反应时间过短或者温度高较难筛选得到阳性克隆。
3.为提高克隆鉴定的效率，尽量减少假阳性，保证鉴定克隆为正向插入克隆，在用PCR方法进行阳性克隆鉴定时，应采用载体上游引物和扩增片段的下游引物进行鉴定或者采用载体下游引物和扩增片段的上游引物进行鉴定。

附：鉴定与测序引物：
载体上游引物 plbu primer: 5’-ATGAAATACCTATTGCCTACG-3’
载体下游引物apd1 primer: 5’-TGGGCCGCACGGTTTTCC-3’

附：外源基因扩增引物设计：
上游引物: 5’-GGCCNNN……NNN-3’
下游引物: 5’-NNN……NNN-3’
NNN：表示对框的外源基因编码序列，可以参照如上所示的载体序列确定。