产品中心

酵母高纯度质粒大量快速提取试剂盒（离心柱型）

一.产品介绍：
   本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合破壁酶特异消化酵母细胞壁，能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除细胞壁后,然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除， 最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点：
1.离心吸附柱内硅基质膜采用进口公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

三.适用范围：
   适用于大规模高纯度酵母质粒制备

四.储存条件：
1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液YP1（终浓度100µg/ml）置于4℃保存。如果溶液YP1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液YP1中补加RNase A即可。
2.环境温度低时溶液YP2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.注意事项：
1.所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到至少6,000xg，带50ml转头的台式离心机。

2.溶液YP3和去蛋白液PD中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

3.通常酵母质粒拷贝数都很低，高拷贝质粒最大得率一般为每5 ml 培养物提取1μg左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为： 1-5μl用做PCR 模板;5-10μl 用于转化大肠杆菌,选择高效率的感受态细胞。

4.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成， 与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。

5.用户需要自备Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巯基乙醇)。配制方法：在600 ml 去离子水里面溶解 182.2克山梨醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要调节PH值，定容到1L，4℃保存。临用前加0.1%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。

6.菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2x107 cells/ml，由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大，以上仅供参考。

7.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保批pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

六.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
   提示：
   第一次使用前请先在漂洗液WB瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
   将RNase A全部加入溶液P1中，混匀。每次使用后置于2-8℃保存。
   将溶液P3放在冰上预冷。
   吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。

1.取约100-180毫升酵母培养物，6000xg，离心10分钟，尽可能的倒干上清，收集菌体。
收集超过50毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个50ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。

2.加入10ml Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；加入0.1g 破壁酶（破壁酶临用前用2ml Sorbitol buffer溶解），充分颠倒混匀，37℃温育1-2小时消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
如果破壁效果不好导致质粒产量过低，可以加大破壁酶用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果，不适合破壁消化的酵母可选用Lyticase 或者Zymolase或者其它方法如加玻璃珠涡旋振荡，反复冻融等。

3.6000xg，离心10分钟，尽可能吸弃上清，加入7ml溶液YP1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。  
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4.加7ml的溶液YP2，温和地上下翻转4 -7次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5.加10ml溶液YP3，立即温和地上下翻转4 -7次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。冰上静置5-10分钟，4℃ ，至少2500xg离心20分钟(加大离心力可相应缩短离心时间,如15000xg离心10分钟)，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。
加入溶液YP3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀，如果上清中还有飘浮白色沉淀，可再次离心后取上清。

6.可选,一般不需要:4℃，2500xg 再次离心10 分钟，小心取上清。

7.将上一步所得上清加入吸附柱DC中（吸附柱放入收集管中），静置2分钟，2500xg离心2分钟，倒掉收集管中的废液。
如果上清体积超过20ml，可以分多次过柱。

8.加入10ml去蛋白液PD，2500xg离心2分钟，弃掉废液。

9.加入10ml漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），2500xg离心2分钟，弃掉废液。

10.重复操作步骤9一次。

11.将吸附柱DC放回空收集管中，最高速（最好大于9000xg，如果离心机转速低，需要相应延长离心时间）离心10分钟以干燥膜基质残留乙醇，用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，室温或者烘箱晾干几分钟。
该步骤目的为彻底去除吸附柱中残留乙醇，残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率，降低质粒产量。如果洗脱产量低，则必须加做步骤12。

12.可选步骤: 选择以下两种方法之一干燥柱子：
 1)取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空15分钟；
 2)将柱子放置于60－65℃真空干燥箱或烘箱中，放置10-15分钟。

13.取出吸附柱DC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1ml洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好），室温放置2分钟，6000 xg离心5分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心2分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于0.6ml，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。