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高纯度质粒大量快速提取试剂盒（离心柱型）

产品介绍：
本试剂盒采用改进 SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。

储存事项:
1. 第一次使用时， 将试剂盒所带全部的RNaseA加入溶液P1后（ 终浓度100μg/ml ）置于4 ℃ 保存 。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的质粒可能会有微量 RNA 残留，在溶液 P1 中补加 RNase A 即可。
2. 环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用后应 及时盖紧盖子。

产品特点：
1. 离心吸附柱内硅基质膜采用进口公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速、方便，从100-200ml 大肠杆菌 LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取 0.2-0.5mg 纯净的高拷贝质粒 DNA，提取率达 80 %左右。
3. 获得的质粒产量高、超螺旋比例高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、
体外转录、测序等各种分子生物学实验。

注意事项：
1. 所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到12,000xg，带50ml转头的台式离心机。
2. 溶液P3和去蛋白液PD中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套， 避免沾染皮肤 、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
3. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液应在70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，提高提取效率。
4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。 电泳可能为单一条带，也可能为2 2 2 2 条或者多条DNA 条带 ，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。 本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过 90% 。
5. 质粒 DNA 确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道 。处于环状或者超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。
6. 洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA ，不影响下游酶切、连接等反应。 也可以使用水洗脱，但应该确保 pH 大于 7.5 ，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱，质粒应该保存－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：
第一次使用前请先在漂洗液 WB 瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
将 RNaseA 全部加入溶液 P1 中，混匀。每次使用后置于 2-8℃保存。
将溶液 P3 放在冰上预冷。
1. 取 150-200 毫升过夜培养的菌液，12,000xg，离心 1-2 分钟，尽可能的倒干上清 ，收集菌体。
收集超过50毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个50ml管内加入更多的菌液 ，
重复步骤 1，直到收集到足够的菌体。
2. 用 7ml 溶液 P1 重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3. 加 7ml 的溶液 P2，温和地上下翻转 4 -7 次使菌体充分裂解，室温放置 3-5 分钟。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组 DNA  剪切断裂！所用时间不应超过 5分钟 ！ 以免质粒受到破坏 。 此时菌液应变得清亮粘稠 。 如果 很浑浊 ， 可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
4. 加 10ml 溶液 P3，立即温和地上下翻转 4 -7 次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。室温或者冰上静置5分钟，4℃ ，12,000xg 离心15分钟，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。
加入溶液P3后应该立即混匀 ， 以免产生SDS的局部沉淀 ， 如果上清中还有 飘浮白色沉淀，可再次离心后取上清。
5. 可选 （一般不需要做）:4℃，12,000xg 再次离心 10 分钟，小心取上清。
6. 将上一步所得上清分多次（每次不超过 15ml）转入吸附柱 DC 中（吸附柱放入收集管中），12,000xg 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液。
7.加入 10ml 去蛋白液 PD，12,000xg 离心 1 分钟，弃掉废液。
8. 加入 10ml 漂洗液 WB （请先检查是否已加入无水乙醇!） ），12,000xg 离心 1 分钟 ，弃掉废液。
9. 重复操作步骤 8 一次。
10. 将吸附柱 DC 放回空收集管中，最高速（最好大于 12,000xg）离心 5 分钟以干燥膜基质残留乙醇，用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，室温或者烘箱晾干几分钟。
该步骤目的为彻底去除吸附柱中残留乙醇 ， 残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率，降低质粒产量骤 。如果洗脱产量低，则必须加做步骤  11 。
11. 可选步骤:选择以下两种方法之一干燥柱子：
1) 取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空 15 分钟；
2) 将柱子放置于 60－65℃真空干燥箱或烘箱中，放置 10-15 分钟。
12. 取出吸附柱 DC，放入一个干净的离心管中， 在吸附膜的中间部位加 1-2ml 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好），室温放置 2-5 分钟，12,000xg 离心 5 分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心2分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积 ，
但是最小体积不应少于1ml，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。

问题与解决方法：