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DNA甲基化检测

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DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关,比如在肿瘤发生时,抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加,CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态,导致抑癌基因表达的下降。


1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP)
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段,则说明该位点存在甲基化;反之,说明被检测的位点不存在甲基化。 

特点:适用范围广,能够检测特异位点是否发生甲基化。

2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶,最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化,称为BSP-直接测序法。将PCR产物克隆至载体后进行测序,可以提高测序成功率,这种方法称为BSP-克隆测序法。

特点:精确度高,能够准确检测出甲基化的程度百分比。


3.焦磷酸测序(Pyrosequencing)

焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点,是较为理想的验证方法,该技术在表观遗传学研究中逐渐成为数据分析的金标准。 灵敏度高,可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平 ,对于样品要求低,适用于新鲜、冷冻和FFPE样本,对于检测位点要求低,可检测未知序列信息,覆盖到人类基因组的所有CpG位点。


实验过程:
1.引物设计及合成
2.DNA提取、质检
3.DNA亚硫酸氢盐修饰
4.MSP/BSP/焦磷酸测序
5.数据分析

送样要求:细胞(≥106 个)、组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥1.5ml)等样品材料,基因组DNA(体积≥20μl,浓度≥50 ng/μl)。

提交的结果:
MSP:引物序列、实验报告、包括MSP产物的电泳图片

BSP:引物序列、测序峰图、实验报告

焦磷酸测序:引物序列、测序峰图、实验报告等