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One Step RT-PCR Kit（一步法反转录PCR Kit）

产品规格：

货号	产品名称	规格	目录价
4204A	One Step RT-PCR Kit(一步法反转录PCR试剂盒)	125T	950
4204B	One Step RT-PCR Kit(一步法反转录PCR试剂盒)	250T	1800

产品介绍：
      本试剂盒是专为一步法RT-PCR实验配制的，使用该试剂盒能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录反应和PCR扩增反应。反应过程中无需打开管盖添加试剂，避免了污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。本试剂盒包括最佳配比优化的OneStep Enzyme Mix（包含突变改造TRUEscript M-MuLV H Minus逆转录酶、热启动HotMaster Taq DNA聚合酶和RNasin抑制剂mix），同时包含适用于逆转录和PCR扩增的独特2 XRT-PCR Mix反应体系。本酶M-MuLV(RNase Hˉ)的RNase H活性缺失，与M-MuLV 相比，具有更强的延伸能力和稳定性，可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。同时该酶提高了耐热性，可以在42-50C反转录，提高了复杂二级结构，GC含量丰富模板反转录效率。

产品存储：－20C 保存，有效期6个月。

适用范围：适用于高拷贝、低拷贝基因检测；部分高GC含量或具有复杂二级结构的RNA模板。

建议反应体系（20 μl-50μl）：
注意：2 XRT-PCR Mix使用前充分融解颠倒混匀（避免剧烈涡旋产生大量气泡）。短期频繁使用可放4C冰箱。
根据下表冰上配制反应液：

Components	Volume	Final Concentration
2×RT-PCR Mix	10 μl	1 X
Forward Primer（10μm）	0.4 μl	0.2 μM
Reverse Primer（10μm）	0.4 μl	0.2 μM
TRUEscript Enzyme Mix	0.8 μl	-
RNA template	X μl	1 pg-1μg
RNase free H2O to final volume	20 μl	Not applicable

注意：引物浓度请以终浓度0.2-0.6μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。如果同进行多个反应，先按比例配成混合液，振荡混匀后，按每管 20-Xμl (X为模板量)分装。

PCR扩增：
1. 将配制好的反应体系混匀、离心后。
2. 将热循环仪预热到42C，将PCR管置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应。
扩增程序：

	温度	时间	循环数
1	42°C	30分钟	1
2	94°C	2-3分钟	1
3	94°C	30 秒	30-40
	50-60°C	30 秒
	72°C	1-2kb/分钟
4	72°C	5-10分钟	1
5	4°C	保温

注意：可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。

注意事项：
●避免RNase污染。
●为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板
●不同的片段，所需最佳RNA模板用量不同，过多的RNA会抑制反应，建议根据反应调整模板用量。
●不能使用Oligo(dT) 和Random Primer 合成cDNA。