咨询热线:400-167-8986

联系我们

Q Q:11955 37948
电话:400-167-8986
手机1:185 1867 6727
手机2:173 0710 7886
订货:order@genenode.com
技术:service@genenode.com
网址:www.genenode.com

核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法
来源:Genenode|君诺德公司     发布时间:2018-08-18     Hits:2530

核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法


20×SSC   

组份浓度 3.0 MNaCl,0.3 MNa3citrate·2H2O(柠檬酸钠·2H2O)

配制量   1 L

配制方法  

1.称量下列试剂,置于l L烧杯中。

NaCl

175.3 g

柠檬酸钠·2H2O

88.2 g

2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。

3.滴加14 N HCl,调节pH值至7.0后,加去离子水将溶液定容至1 L。

4.高温高压灭菌后,室温保存。


20×SSPE Buffer 

组份浓度 3.0 MNaCl,0.2 MNaH2PO4,0.02 MEDTA

配制量    1.L

配制方法  

1.称量下列试剂,置于l L烧杯中。

NaCl

175.3 g

NaH2PO4·H2O

27.6 g

Na2EDTA·2H2O

7.4 g

2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。

3.加NaOH调节pH值至7.4(约6.5 ml的10 N NaOH)。

4.加去离子水将溶液定容至l L。

5.高温高压灭菌后,室温保存。


50 X Denhardt’S溶液 

组份浓度

1%(W/V)

Ficoll 400(菲可400/水溶性聚蔗糖400)

1%(W/V)

Polyvinylpyrrolidone(聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮)

1%(W/V)

BSA

配制量    500 ml

配制方法  

1.称量下列试剂,置于500 ml烧杯中。

Flcoll 400

5 g

Polyvinylpyrrolidone

5 g

BSA

5 g

2.加去离子水约400 ml,充分搅拌溶解

3.加去离子水将溶液定容至500 ml。

4.用0.45µm滤膜过滤后,分装成每份25 ml。

5.-20℃保存。


0.5 M 磷酸盐Buffer 

组份浓度 0.5 M Na2HPO4。

配制量    l L

配制方法  

1.称量134 gNa2HPO4·7H2O置于1 L烧杯中。

2.加入约800 ml的去离子水充分搅拌溶解。

3.加入85%的H3PO4(浓磷酸)调节溶液pH值至7.2。

4.加去离子水定容至1 L。

5.高温高压灭菌后,室温保存。


Salmon DNA  (鲑鱼精DNA)  

组份浓度  10 mg/ml Salmon DNA

配制量    约100 ml

配制方法 

1.称取鲑鱼精DNA2 g置于500 ml烧杯中,加入约200 ml的TE Buffer。

2用磁力搅拌器室温搅拌2~4h,溶解后加入4ml的5 MNaCl,使其终浓度为0.1 M。

3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。

4.回收水相溶液后,使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次,以切断DNA。

5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。

6.离心回收DNA后,溶解于100 ml的去离子水中。测定溶液的OD260值。

7.计算溶液的DNA浓度后,稀释DNA溶液至10 mg/ml。

8.煮沸10min后,分装成小份(1 ml/份)。-20℃保存。

9.使用前在沸水浴中加热5min后,迅速冰浴冷却。


DNA变性缓冲液

组份浓度 1.5 MNaCl,0.5 MNaOH

配制量   1 L

配制方法  

1.称量下列试剂,置于l L烧杯中。

NaCl

87.7 g

NaOH

20 g

2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。

3.加去离子水将溶液定容至l L后,室温保存。


预杂交液/杂交液 (DNA杂交用)

组份浓度

SSC(或SSPE)

Denhardt’s

0.5%(W/V)

SDS

100 µg/ml

Salmon DNA

 配制置    100 ml

 配制方法 

1.称量下列试剂,置于200 ml烧杯中。

20×SSC(或SSPE)

30 ml

50×Denhardt’s

10 ml

10% SDS

5 ml

10 mg/ml Salmon DNA

1 ml

dH2O

54 ml

2.充分混匀后,使用0.45 µm滤膜滤去杂质后使用。


预杂交液/杂交液(RNA杂交用)

组份浓度

SSC(或SSPE)

Denhardt‘s

0.5%(W/V)

SDS

100 g/ml

Salmon DNA

50%(V/V)

Formamlde(甲酰胺)

配制量    100 mL

配制方法  

1.称量下列试剂,置于200 ml烧杯中。

20×SSC(或SSPE)

30 ml

50×Denhardt’s

10 ml

10% SDS

5 ml

10 mg/ml Salmon DNA

1 ml

Formamide(甲酰胺)

50 ml

dH2O

4 ml

2.充分混匀后,使用0.45µm滤膜滤去杂质后使用。


膜转移缓冲液(Western杂交用) 

组份浓度 39 mMGlycine,48 mMTris,0.037%(W/V)SDS,20%(V/V)甲醇

配制量   1 L

配制方法  

1.称量下列试剂,置于l L烧杯中。

Glycine

2.9 g

Tris

5.8 g

SDS

0.37 g

2.向烧杯中加入约600 ml的去离子水,充分搅拌溶解。

3.加去离子水将溶液定溶至800 ml后,加入200 ml的甲醇。

4.室温保存。


TBST Buffer(Western杂交膜清洗液) 

组份浓度 20 mMTris-HCl,150 mMNaCl,0.05%(V/V)Tween 20

配制量   1 L

配制方法  

1.称量下列试剂,置于l L烧杯中。

NaCl

8.8 g

1 MTris-HCl(pH8.0)

20 ml

2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。

3.加入0.5 ml Tween 20后充分混匀。

4.加去离子水将溶液定容至l L后,4℃保存。


封闭缓冲液(Western杂交用)

组份浓度  5%(W/V)脱脂奶粉/TBST Buffer

配制量    100 ml

配制方法  

1.称5 g脱脂奶粉加入到100 ml TBST Buffer中,充分搅拌溶解。

2. 4℃保存待用(本封闭液应该现配现用)。