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FFPE石蜡包埋组织microRNA提取试剂盒(离心柱型)

FFPE Tissue MicroRNA Kit

包装规格：

一.产品介绍：

本试剂盒设计用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取RNA包括microRNA。独特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞释放出RNA，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。得到的RNA可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。

二.产品特点：
1.完全不使用有毒的苯酚，氯*等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
2.快速，简捷，单个样品RNA提取操作一般可在1小时内完成。
3.试剂盒的独家基因组清除柱和配方确保有效清除基因组DNA残留，一般情况下得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
4.多次柱漂洗确保RNA高纯度，可直接用于下游各种实验。

三.适用范围：
适用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取RNA包括microRNA，RNA可直接用于反转录PCR，荧光定量PCR.。

四.储存条件：
1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
2.不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。
3.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。
4.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入0.5毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量)分装冻存，－20℃保存。
5.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.注意事项：
1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.样品处理量绝对不要超过基因组DNA清除柱和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3x106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如不超过2个10μm厚度石蜡切片。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

3.裂解液PKD、结合液RBC中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4.预防RNase 污染，应注意以下几方面：
 1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。
 2)使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
 3)RNA提取过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
 4)配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）

5.关于DNA 的微量残留：
  一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本公司的EASYspin固定包埋组织microRNA快速提取试剂盒，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
 1)选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
 2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

6.RNA 纯度及浓度检测：
完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于石蜡包埋组织福尔马林固定和包埋过程中一般由于RNA与蛋白反应交联会导致RNA断裂或者降解，一般电泳后UV 下只能看到模糊弥散（smear）带型，随着储存的时间越长，降解断裂越严重，甚至只能看到峰值仅仅在100bp左右的模糊条带。这都属于RNA提取正常情况。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

六.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
   提示：      第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量无水乙醇!

1.修整去除过量包埋组织外石蜡，并切片成10-20μm厚切片。切片厚度必须≥10μm，否则太薄会切碎细胞，造成脱蜡过程中microRNA丢失。

2.收集总厚度不超过■40μm的石蜡切片到一个1.5-2ml离心管（例如2片20μm、4片10μm的石蜡切片），或者不超过▲80μm的石蜡切片到一个2ml离心管。
■代表处理切片总厚度≤40μm，▲代表处理切片总厚度≤80μm

3.加入1ml 100%二甲苯，涡旋振荡10秒。瞬间离心把组织全部浸入到二甲苯。

4.50℃水浴3分钟熔解石蜡，20-25℃最高速离心2分钟，收集组织到管底。

5.小心用移液器吸弃上清二甲苯，注意不要吸到沉淀。

6.加入1ml无水乙醇，涡旋振荡，最高速离心2分钟，小心吸弃上清乙醇。

7.加入1ml无水乙醇，重复步骤6一遍，尽可能吸弃所有乙醇。

8.室温或者37℃ 晾干乙醇10分钟或直到所有乙醇挥发干。乙醇完全晾干非常重要，微量的乙醇残留也会导致RNA产量降低。

9.吹打或者涡旋振荡充分重悬组织沉淀在■150μl ▲240μl 裂解液PKD中，短暂离心收集液体到管底，加10μl 蛋白酶K，吹打混匀。

10.55℃孵育15分钟，然后80 ℃孵育15分钟。55℃孵育后，可以将离心管取出放置在室温，等水浴锅温度升到80℃后再放入水浴锅，精确的孵育15分钟。即使2分钟的延长也可能导致RNA的部分降解。

11.加入■320μl ▲500μl 结合液RBC，充分吹打混匀调节结合条件。

12.立刻将混合物加入一个基因组DNA清除柱中，（清除柱放入收集管中）14,000 rpm离心30秒，保留滤过液（RNA在滤过液中）。应避免吸到可能有的较大的未消化完全的絮团物质上柱子，以免堵塞离心柱。

13.加入■1120μl ▲1750μl 无水乙醇到滤过液中，立即吹打混匀，不要离心。如果加1750μl无水乙醇，应先将滤过液转到容量超过3ml的离心管后再加入。

14.立刻将混合物(每次小于700μl，多可以分多次加入)加入一个RNA吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心30秒，弃掉废液。

15.加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。

16.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

17.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，如果需要RNA浓度高，可以将洗脱液放回吸附柱RA，再洗脱一遍。

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