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微量真菌RNA提取试剂盒(离心柱型,gDNA Eraser)
Micro Fungus RNA Extraction Kit with gDNA Eraser(SpinColumn)

一.试剂盒组成、储存、稳定性：

Contents	Storage	RM2121-20 20T	RM2121-50 50T
裂解液 Buffer PLB	室温	25 mL	50 mL
裂解液 Buffer RLT Plus	室温	12.5mL	25mL
去蛋白液 Buffer RW1	室温	20 mL	40 mL
漂洗液 Buffer RW	室温	5 mL	10 mL
		第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free H2O	室温	10 mL	10 mL
基因组DNA清除柱 和收集管	室温	20	50
RNase-free吸附柱SpinRA和收集管	室温	20	50

二.保存条件：
1.本试剂盒在室温（15℃ ~ 25℃）干燥条件下可保存12个月。
2.不合适的储存于低温(4℃或者－20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下(15℃－25℃)进行。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

三.自备物品：
β-巯基乙醇、乙醇、研钵(可选)、无水乙醇、台式高速离心机、水浴锅。

四.产品简介：
基于硅胶柱纯化方式，真菌样品在含高浓度异胍盐裂解液中匀浆裂解，RNA释放到裂解液中。由于裂解液中含有变性剂，内源性或外源性的RNase变性而失活，RNA被保护起来。裂解液经离心去除不溶解的杂质，得到的上清液经gDNA过滤柱过滤去除基因组DNA得到的滤液加入乙醇调节结合条件，混合液转移至柱子中过滤，RNA被吸附上柱子的膜上，而蛋白质和杂质则不被吸附而去除。柱子经去蛋白液Buffer RW1洗涤蛋白质和其它杂质，经漂洗液Buffer RW洗涤去除盐分，最后RNA被RNase-Free H₂O洗脱。

五.产品特点：
1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用优质特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小。
2.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
3.快速，简捷，单个样品操作一般可在25分钟内完成。
4.基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。
5.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.2(100%纯的RNA比值一般是2.2左右)。

六.适用范围：
适用于快速提取真菌组织样品总RNA，使用独有基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，不需要使用DNase消化，RNA可直接用于反转录PCR，荧光定量PCR。

七.注意事项：
1.本产品仅用于科研，禁止用于医药、临床医疗、食品和化妆品等用途。
2.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3.样品绝对不要超过基因组吸附柱SpinDA和RNA吸附柱SpinRA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
4.裂解液Buffer RLT Plus和去蛋白液Buffer RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.预防RNase污染，应注意以下几方面：
1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2)使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3)RNA 在裂解液Buffer RLT Plus 中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4)配制溶液应使用无RNase 的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。)
6.关于DNA 的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本公司由于采取了独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留(一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
1)选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3)将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。还可以用于DNase I处理后的RNA清洁纯化试剂盒(RNAclean)，请联系我们索取操作说明书。
4)在步骤去蛋白液Buffer RW1漂洗前，直接在吸附柱SpinRA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
7.RNA 纯度及浓度检测：
1)完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2 kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
2)纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数(10mMTris, pH7.5)在2.1-2.2 之间(100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司无法达到这个标准，所以1.9-2.0就凑合使用了，但是我们的产品标准一般可以达到2.1-2.2)。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
3)浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free 水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/μL)= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

八.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：
第一次使用前请先在漂洗液Buffer RW瓶加入指定量无水乙醇!
取1 mL裂解液Buffer PLB至离心管内(如果PLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解），在裂解液Buffer PLB中加入5% β-巯基乙醇（1 mL PLB加50 μL β-巯基乙醇）。颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。

1.直接研磨法（实验室无液氮情况下或者柔软易研磨真菌样品推荐此法）:
a.  新鲜真菌组织或者冰冻保存样品称重后取100-200 mg（水分少的样品可加100-150 mg）迅速剪成小块放入研钵，加入1 mL PLB（已加有β-巯基乙醇）室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液Buffer PLB立刻充分接触以抑制RNA酶活性。β-巯基乙醇是裂解液Buffer PLB的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10-20%。如果特别复杂植物，可以尝试在裂解液中加入PVP40至终浓度2%。
b.  将裂解物转入离心管，立即剧烈振荡15秒，短时放回 65°C水浴中（5-10 min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。13,000 rpm离心5-10 min，沉淀不能裂解的碎片。
c.  取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。
d.  立刻接操作步骤的步骤3。

2.液氮研磨法（适用广泛提取复杂难破碎，易降解样品时推荐此法）:
a. 液氮中研磨新鲜或-70°C冷冻的材料至细粉。
b.  转移100-200 mg细粉加至预热的裂解液Buffer PLB（已加有β-巯基乙醇）离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
c.  短时放回65°C水浴中（5-10 min）,中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。
d.  将裂解物13,000 rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。
e.  取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。
f.  立刻接操作步骤3。

3.将混合物(每次小于750 μL，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，（清除柱放入收集管中）13,000 rpm离心1 min，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

4.将基因组DNA清除柱子放在一个干净2 mL离心管内，在基因组清除柱内加500μL裂解液Buffer RLT Plus，13,000 rpm离心30秒，收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450-500 μL左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

5.立刻将混合物(每次小于750 μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱SpinRA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心1 min，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

6.加入700 μL去蛋白液Buffer RW1，室温放置1分钟，13,000 rpm离心30秒，弃掉废液。

7.加入500 μL漂洗液Buffer RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm离心30秒，弃掉废液。

8.再次加入500 μL Buffer RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm离心3分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9.小心的取出吸附柱SpinRA（不要让吸附柱SpinRA碰到收集管里面的废液），放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加20-30 μL RNase free water（70-90℃水浴加热可提高产量），室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

如果预期RNA产量>30 μg，加20-30 μL RNase free water重复步骤9，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低,用户根据需要选择。