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组织/细胞RNA提取试剂盒(离心柱型,DNase I)

Tissue/Cell RNA Extraction Kit with DNase I(SpinColumn)

一.试剂盒组成、储存、稳定性：

二.保存条件：

1.本试剂盒在室温（15℃ ~ 25℃）干燥条件下可保存12个月。

2.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

3.不合适的储存于低温(4℃或者－20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下(15℃－25℃)进行。

4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

三.自备物品：

无水乙醇、台式高速离心机、水浴锅。

四.产品简介：

独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离子盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H₂O将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

五.产品特点：

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用优质特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小。

2.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

3.快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。

4.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达2.1-2.2（100%纯的RNA比值一般是2.2左右）。

六.适用范围：

适用于快速提取各种细胞组织总RNA。

七.注意事项：

1.本产品仅用于科研，禁止用于医药、临床医疗、食品和化妆品等用途。

2.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

3.需要自备乙醇，一次性注射器，研钵。

4.裂解液Buffer RLT 和去蛋白液Buffer RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5.预防RNase 污染，应注意以下几方面：

1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。

2)使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3)RNA 在裂解液Buffer RLT 中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4)配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）

6.关于DNA 的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本公司由于采取了独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

1)选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。

2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

3)将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。还可以使用DNase I处理后的RNA清洁纯化试剂盒(RNAclean)，请联系我们索取操作说明书。

4)在去蛋白液Buffer RW1漂洗前，直接在吸附柱SpinRA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。

7.RNA 纯度及浓度检测：

1)完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2 kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

2)纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数(10mM Tris, pH7.5)在2.1-2.2之间（100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司无法达到这个标准，所以1.9-2.0就凑合使用了，但是我们的产品标准一般可以达到2.1-2.2）。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA样品，假定在10 mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

3)浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/μL )= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

八.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：第一次使用前请先在70%乙醇和漂洗液Buffer RW中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！

实验前准备：

取一个新的1.5 mL离心管，加入45 μL DNase I buffer和5 μL RNase free DNase I，轻轻吹打混匀成DNase I工作液（处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液），置冰上备用。

1.组织培养细胞

a.收集<10⁷悬浮细胞到一个1.5 mL离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。

b.13,000 rpm离心10秒（或者300 × g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。

c.轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入350 μL (<5×10⁶细胞)或者600 μL (5×10⁶-1×10⁷细胞)裂解液Buffer RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

d.用带钝针头的一次性1mL（配0.9 mm针头）注射器抽打裂解物5-10次或直到得到满意匀浆结果（或者电动匀浆30秒），可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。

e.接操作步骤项下3。

2.动物组织（例如鼠肝脑）

a.电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块，加入350 μL (<20 mg组织)或者600 μL (20-30 mg组织)的裂解液Buffer RLT后电动彻底匀浆20-40秒。

b.液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20 mg/30 mg)转入装有350 μL /600 μL 组织裂解液Buffer RLT的1.5 mL离心管中，用手剧烈振荡20秒，充分裂解。用带钝针头的一次性 1 mL（配0.9 mm针头）注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果（或者电动匀浆30秒），可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。

c.将匀浆后裂解物13,000 rpm离心3分钟，沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物，将裂解物上清小心转到一个新离心管。

d.接操作步骤项下3。

3.较精确估计裂解物（上清）体积，加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇！），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

4.立刻将混合物（每次小于700 μL，多可以分两次加入）加入一个吸附柱SpinRA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心60秒，弃掉废液。

5.加350 μL去蛋白液Buffer RW1，室温放置30秒，12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。

6.向吸附柱SpinRA 中央加入50 μL的DNase I 工作液（实验前制备），室温（20-30℃）放置15 分钟。注意直接将工作液滴在膜中央上，不要让工作液滴在O型圈或是离心柱管壁上。

7.向吸附柱SpinRA 中加入350 μL去蛋白液Buffer RW1，12,000 rpm离心30-60 秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

8.加入500 μL 漂洗液Buffer RW（请先检查是否已加入无水乙醇！），12,000 rpm离心30秒，弃掉废液。加入500 μL漂洗液Buffer RW，重复一遍。

9.将吸附柱SpinRA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10.取出吸附柱SpinRA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50 μL RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量），室温放置1分钟，12,000 rpm离心1 min。

如果预期RNA产量>30 μg，加30-50 μL RNase free water重复洗脱，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复一遍（如果需要RNA浓度高）。

洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高；分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。