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免氯仿超纯总RNA提取试剂盒(离心柱型)

Chloroform-Free UltraPure Total RNA Extraction Kit (SpinColumn)

一.试剂盒组成、储存、稳定性：

二.保存条件：

1. 试剂盒在室温(15℃~25℃)干燥条件下可保存12个月，其中裂解液Buffer RL在4℃避光条件下保存12个月，常温避光保存3个月也不影响使用质量。

2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

三.自备材料：

四.产品简介：

超纯总RNA快速提取试剂盒适用于各种动植物组织及细胞的总RNA提取。裂解液Buffer RL可以高效裂解组织细胞，灭活RNA酶；结合特异性的吸附柱，可以提取无蛋白、基因组、细胞代谢物等杂质污染的高纯度、高质量的总RNA。

提取的总RNA完整性好，无蛋白和DNA污染，可用于各种分子生物学常规实验，如RT-PCR、Real Time PCR、Northern blot、Dot blot、poly A筛选、体外翻译、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。

五.适用范围：

本试剂适用范围广泛，可以从动物组织、植物材料、各种微生物及培养细胞等样品中提取总RNA。

六.产品特点：

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用优质特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小。

2. 结合了异硫氰酸胍/酚一步法试剂稳定性好，纯度高和离心柱方便快捷的优点，不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程，RNA直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。

3. 独特的Buffer RL裂解液配方，可以有效的消除基因组污染。

4. 多次柱漂洗去除杂蛋白和细胞代谢物，提取RNA纯度高。

5. 有效的去除了5S在总RNA中含量，提高了纯度。

七.使用注意：

1.裂解液Buffer RL和去蛋白液Buffer RE含有刺激性有害化合物，是强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤时，请用大量清水或者生理盐水冲洗，严重时请立即到医院进行处理。

2.第一次使用前请先在漂洗液Buffer RW瓶中加入指定量无水乙醇，加入后及时打钩标记已加入无水乙醇，防止重复添加。各溶液使用后应及时盖紧盖子，避免试剂挥发变性，影响实验效果。

3.样品用裂解液Buffer RL匀浆后，如果不即刻加入分离相Buffer EX之前，置于-70°C下可放置一个月以上。

4.RNA半衰期比较短，容易降解，建议提取后尽快进行后续实验。

5.样品处理量绝对不要超过RNA吸附柱SpinRA的处理能力，否则造成DNA残留或提取产量降低。

6.若下游实验对DNA非常敏感，建议用 RNase free DNase I（货号R2128）或DNase I柱上消化试剂盒（货号R2127）对RNA进行处理。

7.实验操作中要避免RNase的污染和样本间的交叉污染。推荐使用RNaseAway固体表面RNase清除剂（货号R2133），移除非一次性设备的污染。

八.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

实验前准备：

1.尽量使用无菌RNase-free离心管、枪头等一次性塑料耗材，若使用玻璃器皿或非一次性工具应提前用DEPC处理或移除RNAse污染产品。

(1)将要处理的器皿工具用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在避光条件下，静置处理12小时。

(2)然后在121℃下高压灭菌30分钟以除去残留DEPC。

2.请穿戴实验服、一次性乳胶手套、一次性口罩进行试剂配制和实验操作，避免人为的 RNase污染。

样品前处理：

1.组织匀浆：

a.植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在裂解液Buffer RL中迅速研磨，每50-100 mg组织加入1 mL 裂解液Buffer RL，混匀。注意：样品体积一般不要超过裂解液Buffer RL体积的10%。

b.动物组织：取新鲜或-70℃冻存动物组织尽量剪碎，每30-100 mg组织加入1 mL裂解液Buffer RL，匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入裂解液Buffer RL 1mL混匀。注意：样品体积一般不要超过裂解液Buffer RL体积的10%。

c.单层培养细胞（贴壁细胞）：尽量去除干净残留培养液后直接往直径3.5 cm的培养板中加入1 mL 的裂解液Buffer RL覆盖并反复吹打裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的裂解液Buffer RL量（每10 cm²加1 mL）。当裂解液Buffer RL 量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。

注意：贴壁培养细胞往往不能完全从培养瓶（皿）脱落，这并不意味着裂解不完全，此时细胞膜实际已经完全破裂开，并已释放出RNA，继续做即可。

d.悬浮细胞：离心收集细胞。在裂解液Buffer RL 试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每5~10×10⁶的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×10⁷细菌加1 mL的裂解液Buffer RL。在加入裂解液Buffer RL 前应避免洗涤细胞，因为那样会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。

e.若提取细菌RNA，推荐细菌RNA提取试剂盒(离心柱型) #货号R2120；
若提取血液RNA，推荐TRI全血(液体样本)总RNA提取试剂盒 #货号R2108。

提取步骤：

2.将匀浆样品剧烈震荡后在室温下放置5分钟以使核蛋白体完全解离。

3.可选步骤：在4°C的条件下以12,000 rpm的离心力离心10分钟，取上清。如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或肌肉，植物的块茎结节等可离心去除。离心后的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织的样品时，上层是大量油脂应除去，取澄清的匀浆液进行下一步。

4.每1mL裂解液Buffer RL加100 μL氯仿代替物Buffer EX，代替氯仿200 μL进行抽提，盖紧管盖，剧烈震荡15秒并将其在室温下放置3分钟。

5.在4°C 12,000 rpm的离心力高速冷冻离心10-15 min。离心后混合物分成三层：下层红色有机相，中间相，上层无色水相。RNA存在于上清水样层中。水样层的容量大约为所加裂解液Buffer RL容量的50-60%。

6.吸取600 μL水样层小心转移到新的Rnase-free离心管中（不要触碰中间层），记录水相体积，加入上清水相0.5倍体积的300 μL无水乙醇，立即吹打混匀。

7.将混合溶液（每次小于700 μL，可分两次加入）转入吸附柱SpinRA，12,000 rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。

8.加500 μL去蛋白液Buffer RE，室温12,000 rpm离心45秒，弃掉废液。

9.加500 μL漂洗液Buffer RW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心45秒，弃掉废液。

10.重复步骤9一次。

11.将吸附柱SpinRA放回空收集管中，室温13,000 rpm离心2 min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

12.取出吸附柱SpinRA（避免吸附柱SpinRA的底部碰到收集管里面的废液），放入新的RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位滴加50~80μL RNase-free H₂O，室温静置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟。取得RNA后，将RNA溶液保存在－80℃，防止降解。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积最好不少于30μL，体积过小降低RNA洗脱效率，减少RNA产量。

附录：

RNA纯度的检验和分析：

1. 电泳分析

琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析RNA的质量。未降解的RNA可以观测到三条明亮、清晰、锐利的RNA条带，分别在5 Kb左右（28S，rRNA），2 Kb左右（18S， rRNA），0.2 Kb左右（5S，tRNA）。28S条带亮度为18S条带亮度的两倍，5S条带最淡，使用试剂盒提取时可能会只有两条带，没有5S条带。如果检测未成熟的前体RNA或不均一核RNA、小核RNA提取出来的条带为介于7 Kb和15 Kb之间的不连续高分子量条带。如果观测的条带弥散、5S条带明亮则说明RNA已降解。

2. 吸光度分析

使用分光光度计测定RNA浓度时，一般采用OD260/OD280的比值，即蛋白和核酸的比值。纯RNA的OD比值在1.8~2.1之间。当R<1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸。

问题与解决方法：

提取的RNA产量低

1. 样品未完全研磨匀浆或裂解。根据初始材料选择合适的裂解方式；将样本剪碎，必要时适量减少样本材料，浸入裂解液与其充分接触并研磨匀浆。

2. 样品质量差。使用新鲜样品或在－80℃液氮中冷冻样品。

3. 吸附柱堵塞。离心去除有机杂质和杂蛋白，仅上清水相转入新离心管中。

4. 漂洗液未加入乙醇，第一次使用前按说明加指定量乙醇。

5. 洗脱步骤时添加不正确。确保ddH₂O滴加到了吸附柱膜的中间位置。

RNA OD260/OD280吸光度比值<1.6

1. RNA洗脱未使用pH7.5 10 mM Tris-HCl，低离子强度或低pH值会使OD280值升高。

2. 吸附柱在漂洗液洗涤后有乙醇残留。可以延长空管离心操作的时间，增加至2分钟，或将吸附柱置于室温通风处5分钟，以充分除去残留乙醇。

提取的RNA降解

1. 样品的收集保存、实验操作中裂解等步骤处理不当。新鲜样品应立即放入液氮中速冻，之后保存在－80℃冰箱中且避免反复冻融。或使用RNA样品储存液保护样品。

2. 操作过程中或实验试剂被RNase污染。在实验前清洁实验台，穿戴一次性手套、口罩，使用RNase-free的实验耗材，及时更换被污染的试剂。

下游反应受到抑制

乙醇存在于纯化的RNA中。在洗脱RNA之前，吸附膜必须离心干燥晾干，残留的微量乙醇会抑制下游的酶反应。