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Trizol法DNA提取试剂盒

Trizol Method DNA Extraction Kit

一. 试剂盒组成、储存、稳定性：

二. 产品介绍：

TRIzol法DNA提取试剂盒可以用于广谱型总RNA和DNA提取。实验操作快速方便，颜色鲜明，便于分层。本试剂适用范围广泛，可以从动物组织、植物材料、各种微生物及培养细胞等样品中提取总RNA和DNA分离提取。

RNA Extraction Reagent(TRIzol)方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×10⁶)以及大量的组织(≥1g)和细胞(>10⁷)均有较好的分离效果。样品在RNA Extraction Reagent(TRIzol)中被充分裂解的同时能够最大限度地保证RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液会分成三层：上层无色水相、中间层和下层红色有机相，RNA 分布在上清层中。收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。

三. 储存事项：

RNA Extraction Reagent(TRIzol) 在室温下能稳定保存12个月。尽管如此，为达到最佳效果，我们建议保存在2~8°C的避光环境下。

四. 重要提示：

本品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触，应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。

五. 注意事项：

1. 本产品仅用于科研，禁止用于医药、临床医疗、食品和化妆品等用途。

2. RNA Extraction Reagent(TRIzol)含有刺激性有害化合物，是强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤时，请用大量清水或者生理盐水冲洗，严重时请立即到医院进行处理。

3. 样品用RNA Extraction Reagent(TRIzol)匀浆后，如果不即刻加入氯仿之前，置于-70°C下可放置一个月以上。保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2-8°C可以保存一周，-20°C条件下可以保存1年。RNA半衰期比较短，容易降解，建议提取后尽快进行后续实验，如反转录成cDNA，Northern Blot等。

4. 实验操作中要避免RNase的污染和样本间的交叉污染。推荐使用RNase Away高效固体表面RNase清除剂(货号：R2133)，移除非一次性设备的污染。

六. 客户自备材料：

七. 实验前准备：

1. 尽量使用无菌RNase-free离心管、枪头等一次性塑料耗材，若使用玻璃器皿或非一次性工具应提前用DEPC处理或移除RNAse污染产品。

(1) 将要处理的器皿工具用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在避光条件下，静置处理12小时。

(2) 然后在121℃下高压灭菌30分钟以除去残留DEPC。

2. 请穿戴实验服、一次性乳胶手套、一次性口罩进行试剂配制和实验操作，避免人为的 RNase污染。

八. TRIzol法DNA抽提操作步骤：(实验前请先阅读注意事项)

提示：用RNA Extraction Reagent (TRIzol)抽提DNA时要戴手套和护眼罩，避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作避免呼吸道吸入。如无特殊说明，所有的操作在15~30℃室温条件下。

（一）样品前处理：

1. 组织匀浆

a.  植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在TRIzol中迅速研磨，每50-100 mg组织加入1 mL TRIzol，混匀。注意：样品体积一般不要超过TRIzol体积的10%。 

b.  动物组织：取新鲜或-70℃冻存动物组织尽量剪碎，每30-100 mg组织加入1 mL TRIzol，匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入TRIzol 1 mL混匀。注意：样品体积一般不要超过TRIzol体积的10%。

c.  单层培养细胞(贴壁细胞)：尽量去除干净残留培养液后直接往直径3.5 cm的培养板中加入1 mL 的TRIzol覆盖并反复吹打裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIzol 量(每10cm²加1mL)。当TRIzol 量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。

d.  注意：贴壁培养细胞往往不能完全从培养瓶(皿)脱落，这并不意味着裂解不完全，此时细胞膜实际已经完全破裂开，并已释放出RNA，继续做即可。

e.  悬浮细胞：离心收集细胞。在TRIzol 试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每5~10×10⁶的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×10⁷细菌加1 mL的TRIzol。在加入TRIzol 前应避免洗涤细胞，因为那样会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。

f.  血液：推荐使用本公司的TRI LS Reagent(货号：R2107) ，这是全血或者液体样品专用的TRIzol Reagent，LS就是Liquid Sample，相当于Invitrogen公司的TRIzol LS。

（二）裂解液离心分层：

2. 将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5分钟以使核蛋白体完全解离。

3. 可选步骤：在4°C的条件下以12,000 rpm的离心力离心10分钟，取上清。

如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或肌肉，植物的块茎结节等可离心去除。离心后的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织的样品时，上层是大量油脂应除去。取澄清的匀浆液进行下一步。

4. 每1 mL TRIzol加0.2 mL氯仿(客户自备，推荐购买相对安全的氯仿代替物，货号R2138)。盖紧管盖，剧烈震荡15秒并将其在室温下放置2~3分钟。

5. 在4°C 12,000 rpm的离心力高速冷冻离心10-15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色有机苯酚氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA存在于上清水样层中。水样层的容量大约为所加TRIzol 容量的50-60%。

（三）DNA分离提取步骤：

1. 彻底去除上层富含RNA的水相后，用无水乙醇沉淀中间层和下层有机相中的DNA。考虑到下层有机相还有未完全裂解的组织和细胞样品残留，会增加后续DNA提取的杂质残留去除难度，需将无杂质的中间层和下层有机相转移至到干净的1.5 mL离心管中，每1 mL TRIzol加入0.3 mL无水乙醇，颠倒混匀后室温放置2-3分钟。

2. 在2-8℃下以不超过2,000 g的离心力离心5分钟，沉淀DNA。

3. 小心去除上清液，用500 μL SC Buffer洗涤DNA沉淀两次，每次洗涤后离心去除上清液留管底的DNA。在室温下浸泡洗涤10-30分钟，期间多次混匀，然后在2-8℃下以2,000x g离心5分钟，去除上清液。

4. 用500 μL 75%的乙醇(客户自备)再次洗涤DNA沉淀两次，每次洗涤后离心去除上清液留管底的DNA。在室温放置5-10分钟，期间多次混匀，在2-8℃下以2,000×g离心5分钟，去除上清液。

5. 打开离心管盖，室温干燥DNA沉淀5-10分钟，加入100-300 μL的8 mM NaOH溶液溶解DNA，-20℃避光可稳定存放1~2年；4℃可短期存放1周。

附录

RNA分离提取步骤：

1. 将水样层转移到一干净的离心管中，加入等体积异丙醇。颠倒混匀后室温放置10分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

2. 在室温或者4°C 12,000 rpm 离心10分钟，弃上清。

3. 加入75%乙醇(客户自备)洗涤沉淀。每使用1 mL TRIzol用1 mL 75%乙醇对沉淀进行洗涤。

4. 在室温或者4°C 12,000 rpm离心3分钟，弃上清，注意不要丢失RNA沉淀。

注意：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。

5. 室温放置2-3分钟，晾干。加入30-100 μL RNase free water，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。