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CTAB法植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)

包装规格：

一.产品介绍：
改进的经典CTAB植物DNA抽提液内（添加多种针对植物特点的多糖、多酚去除成份）迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白质（根据需要，上清中还加入异丙醇离心沉淀基因组DNA，进一步去除其它各种杂质），然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤， 进一步将多糖、多酚和细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点：
1.离心吸附柱内硅基质膜采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
3.快速，简捷，单个样品操作一般可在1小时内完成。
4.数种去多糖、多酚成份和多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达30 kb -50kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。

三.适用范围：
   适用于快速提取植物基因组DNA.

四.储存条件：
1.裂解液PL、结合液PQ或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在55℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.注意事项：
1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.开始实验前将需要的水浴先预热到65℃备用。
3.需要自备氯仿或者氯仿/异戊醇（体积比24：1混合）、无水乙醇和β-巯基乙醇。
4.结合液PQ 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.不同来源的植物组织材料中提取DNA 的量会有差异，一般100mg新鲜组织典型产量可达3-25μg。
6.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA， 不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱， 但应该确保pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱 （10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
本试剂盒是按照标准提取过程配置各溶液体积，如果样品DNA含量低或者产量低，需要扩大提取量，还需要另外购买溶液。

六.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
    提示：
         第一次使用前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加入指定量的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
         取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使用前加入β-巯基乙醇到终浓度2%。

1.取适量植物组织（新鲜组织100 mg 或干重组织30 mg）在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。

2.转移细粉到一个1.5ml离心管，不要解冻，加600μl 65℃预热的裂解液PL (确认已加入β-巯基乙醇至2%)，剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头轻柔吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。

3.65℃水浴20-60分钟，在水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
可选:如果组织干燥或者产量低，可以适当延长水浴时间。如果RNA残留多，可在水浴前加入6μl RNA酶（20mg/ml）。
注：如果提取的DNA残留RNA较多导致电泳时候条带拖尾，条带扭曲，背景很高等不正常电泳情况，可以加1% RNA酶（10mg/ml）37℃或者室温放置半小时即可消化RNA，消化完后不需要特殊处理便可用于PCR或者酶切。

4.加入700μl氯仿或者氯仿/异戊醇（体积比24：1混合），颠倒充分混匀几分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离心5分钟。
若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前用等体积酚/氯仿（1：1）抽提一遍。

5.小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管，注意不要吸到界面物质。
如上清比较浑浊，则需要重复步骤4一遍，直到得到透亮上清。

6.较精确估算上清量，加入1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加入无水乙醇!）后立刻涡旋，充分混匀。此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。

7.将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液（先加700μl离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心）。

8.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

9.加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

10.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

11.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

12.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果预计和需要产量高，可增大洗脱体积，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

13.DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。

附录（低DNA含量或者产量低样品操作步骤）：
1.取适量植物组织（新鲜组织400 mg 或干重组织200 mg）在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。
2.转移细粉到一个15ml离心管，不要解冻，加入9ml 65℃预热的裂解液PL (确认已经加入β-巯基乙醇至2%)，剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。
3.室温放置60分钟，中间不时颠倒离心管以混合样品数次。
如果组织干燥或者产量低，可以放置在65℃水浴。
4.加4.5ml氯仿/异戊醇（体积比24：1混合），涡旋充分混匀，3,000g 离心10分钟。
5.小心吸取上清到一个新的15ml离心管，注意不要吸到界面物质。重复一遍步骤4。
6.小心吸取上清到一个新的15ml离心管，估算上清量，加入0.7倍体积的异丙醇，涡旋混匀来沉淀DNA。
7.立刻3,000g 离心20分钟沉淀DNA，弃上清，颠倒离心管口放在纸巾上控干残留液体，并小心用用移液枪吸干沉淀周围残留液体（不要过于干燥DNA沉淀）。
8.加入300μl－400μl预热到65℃的灭菌水，重新溶解DNA，可能需要在65℃短暂温育帮助溶解，期间不断轻弹管底帮助溶解。
9.加入1.5倍体积结合液PQ（450μl－600μl，请先检查是否已加入无水乙醇!）后立刻涡旋，充分混匀。此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。
10.后续步骤和上面标准操作步骤7开始后完全一样。